EIF4A3-induced circular RNA MMP9 (circMMP9) acts as a sponge of miR-124 and promotes glioblastoma multiforme cell tumorigenesis
知识积累
多形性胶质母细胞瘤（Glioblastoma multiforme，GBM），也称为IV级胶质瘤，是最具侵袭性的胶质瘤，尽管综合治疗策略取得了进展，包括手术，放疗和化疗，但患者的中位生存期几乎没有改善，仅持续约14个月，低于3％至5％的人存活超过5年。如果不进行治疗，生存期通常为三个月。
主要材料与方法
- 材料及数据获取
18例患者GBM组织中挑取三对，使用Microarray 获得circRNA及miRNA数据
- 实验方法
- pull-down assay
- RNA binding protein immunoprecipitation (RIP) assay
- Animal studies
主要结果
- 作者GO分析聚类结果中挑取差异表达TOP 20上调和下调的circRNA (Fig. 1a)，最终选择hsa_circ_0001162 (circMMP9)作为后续分析对象 (Fig. 1b)，其由MMP9 12号外显子及13号外显子组成 (Fig. 1c)。并通过PCR、定量及FISH定位(Fig. 1d-h)。
- 首先作者验证了过表达circMMP9载体在低表达的U87细胞中表达情况(Fig. 2b-d)，并设计siRNA1、siRNA2沉默U251细胞中高表达circMMP9(Fig. 2e,j and l)。在过表达的U87细胞中，观察到circMMP9能够显著促进其迁移及入侵的能力，而U251这方面能力被削弱(Fig. 2o and p)。
- 定位发现，circMMP9主要在细胞质中表达，具有miRNA海绵功能的潜力。miRNA芯片数据差异分析结果及RegRNA 预测结果显示，circMMP9可以作为GBM中miR-124的海绵。FISH实验显示circMMP9和miR-124共定位于U87细胞的细胞质中(Fig. 3d and g)；在U251细胞中沉默circMMP9显着增加miR-124表达； U251细胞中circMMP9的沉默显着增加miR-124表达，而FISH测定表明circMMP9和miR-124抑制剂（抗miR-124）减弱了这种抑制。另外，circMMP9的沉默降低了增殖相关标志物（PCNA和Ki-67）的表达水平(Fig. 4b)。Western blot assays显示circMMP9 / miR-124共同调控了EMT过程，与circMMP9和miR-124呈负相关。
- 随后作者探究了circMMP9上下游关系。根据肿瘤细胞的ceRNA调控模型，以及PubMed数据库筛选获得CDK4及AURKA是miR-124的靶基因，并通过ICH及western blotting验证。通过（https：//circinteractome.-nia.nih.gov/index.html）搜索获取circMMP9 mRNA上有区域的蛋白eIF4A3，并将其4个结合位点命名为a,b,c,d。通过RNA pull-down实验验证，circMMP9上游的序列含有eIF4A3结合位点(Fig. 6c)。
- 作者敲低了eIF4A3的表达发现circMMP9表达(Fig. 6d)，而eIF4A3的过表达增加了circMMP9表达(Fig. 6e)。最后将转染的细胞注释到裸鼠中，分7,14,21,28天观测肿瘤生长情况。结果表明，circMMP9的过表达导致异种移植物皮下肿瘤生长速率的显着增加 (Fig. 7a-b)，并上调CDK4和AURKA表达(Fig. 7c)。circMMP9的沉默导致异种移植物皮下肿瘤生长速率的显着降低(Fig. 7d-e)，同时下调CDK4和AURKA表达(Fig. 7f)。
