这是一篇较早的由Broad研究所和麻省总医院(MGH)发表于《Science》上的一篇关于scRNA-seq揭示胶质母细胞瘤瘤内异质性的文章 Single-cell RNA-seq highlights intratumoral heterogeneity in primary glioblastoma。这是第一次获取胶质母细胞瘤中的单个细胞进行大规模单细胞测序的研究。GBM是一种典型的异质性和致死性极高的肿瘤。而能够揭示同一个肿瘤内多种细胞类型目前唯一的方法是做单细胞测序，这篇文章是2014年发表，用的是SMART-seq测序方法，总共测序672个细胞。
实验设计和结果
首先通过质控，总共筛选得到430个细胞、~6000个基因用于后续分析。当时的细胞数较少。虽然在单细胞测序筛选的是GBM细胞，作者仍然判断在这些细胞中是否还存在又正常细胞。作者通过基因的平均表达水平来判断大规模的CNV的情况。这里作者结合之前发表文章里bulk RNA-seq的数据，及正常脑组织的表达情况作为control，来分析430个细胞中是否还含有正常细胞。结果表明，这当中有10个离群细胞可判断为正常细胞。剩下的420个细胞中认为是肿瘤细胞。
从热图中可以看出7号染色体缺失，10号染色体扩增在GBM中普遍存在。接下来作者采用多维尺度分析（MDS）方法进行降维，现在用的最多的是tSNE进行降维。通过降维之后，看不同样本的肿瘤细胞的分布情况。
图中可以看出，在转录组水平上存在广泛的肿瘤异质性。可以看到，一个肿瘤样本中的细胞会出现在另一个肿瘤细胞的cluster中。作者又发现表面受体相关的基因EGFR, PDGFRA, PDGFA,FGFR1, FGF1, NOTCH2, JAG1，在单细胞中表达上调。
通过几类基因集（细胞周期相关，低氧，免疫应答和少突细胞marker）鉴定出几类signature。
从B图中可以看出，细胞周期相关marker gene高表达的细胞并不多，MGH31中仅有1.4%,在MGH30中有21.9%,跨度很大。这个结果与体外培养GBM细胞不同，体外培养体细胞基本100%都高表达细胞周期marker gene。反过来，作者又看了细胞静止相关的marker gene（HES1, TSC22D1和KDM5B）,TSC22D1和KDM5B在不处于细胞周期的肿瘤细胞中高表达，HES1由于最初筛选被过滤掉。
GBM中含有一类原始干细胞亚群（GSCs）,这类细胞是对现有治疗手段首先出现耐药性。GBM也被认为含有更多的分化细胞（DGC），这些细胞可以从附着的单细胞层展开。作者用三个样本（MGH26,MGH28和MGH31）中的GSC和DGC进行细胞培养，GSC表达出干细胞样特性，表达干细胞marker CD133，并促进肿瘤的增殖。
这里作者又构建出干细胞样signature,也就是在GSC中高表达而在DGC中低表达的基因。
用干细胞样signature对每个样本中几类基因的表达情况分别进行皮尔森相关分析，可以看出，这些基因与细胞周期相关基因表达呈负相关。
TCGA将GBM分为4类：proneural，neural,classical和mesenchymal，这种分类是依据bulk RNA-seq数据。作者在单细胞水平上看一个肿瘤中单个细胞得分类是否不同。
从热图中可以看出，不同得肿瘤中不同类型的细胞含量不同，MGH26主要为PN型，MGH28和MGH29主要为MES型，MGH30主要为CL型。总的来说，五个样本中同时含有四种亚型的细胞，不管肿瘤中的主要细胞类型是哪一种，每一个肿瘤中都有PL亚型的细胞。这是首次在单细胞水平上将肿瘤细胞分为四种类型。
最后作者分析了肿瘤异质性是否与预后相关，将proneural肿瘤分为三种类型，1)单一的proneural肿瘤且没有转化为其他类型肿瘤的信号；2）低异质性肿瘤，其他亚型信号不明显，3）高异质性肿瘤，其他亚型信号明显。作者发现随着肿瘤异质性的增加，预后变差，这一发现具有重大意义。
这是第一次获取胶质母细胞瘤中的单个细胞进行大规模单细胞测序的研究。第一次从单细胞水平上发现同一个肿瘤中含有不同亚型的细胞，且肿瘤异质性程度越高，预后越差。
